FDA讨论基于质谱技术的临床应用相关问题

快盈llI下载app 质谱技术是19世纪末发现的1项划时期技术，它通过测定物资的份子量而为探索物资的结构提供了丰富的信息。而将分离技术与质谱技术结合则是分离科学的1项突破性进步。比如采取质谱法作为气相色谱的检测器早已成为1项标准化的GC技术，但由于GC-MS不能分离不稳定和不挥发的物资，所以又逐步发展出了液相色谱与质谱连用的技术。到现在，不管是GC-MS，CE-MS，还是LC-MS都已成了分析化学领域的常规技术。

快盈llI下载app 与传统的分析化学领域不同，能够利用于临床检测领域的技术不但要能够满足对物资检测特异性的要求，还要能够满足临床检验对准确性、重复性和线性度等要求。因此，任何1项能够被国家监管机构批准的临床检测，都不单单是1项技术的革新，而更是1整套具有完备技术说明、工作流程和数据规范的工作系统。

在我国，截止到2016年4月30日，CFDA总共批准了与质谱技术相干的进口器械12项，国产器械8项。这1数量与诸如生化、免疫、化学发光等技术的大量批件相比实在比例甚微，说明在这1方面在未来会有非常大的增长空间。

快盈llI下载app 在目前获批的质谱技术相干批件中，主要分为两大类。1类是针对小份子代谢物的检测，比如利用于新生儿代谢病筛查的丙氨酸、甘氨酸、25-羟基维生素D，和同型半胱氨酸等的LC-MS、LC-MS/MS方法;另外一类是采取MALDI-TOF质谱技术对大份子进行检测的质谱技术，这1技术目前主要利用于对微生物的鉴定。

快盈llI下载app 随着技术的不断发展，不单单是针对基因水平的研究愈来愈深入，针对蛋白的研究也正在不断的与临床检测具有愈来愈多的结合。除现有的ELISA，免疫和化学发光技术，基于质谱的技术在不久的将来1定会在蛋白质、蛋白组学、代谢组学领域成为对蛋白进行定量和监测的重要技术，而将其利用于临床检测领域也将是下1个10年的检验领域的大事件。为此，美国FDA于5月初举行了1次大型的政府-高校-厂家的多方会谈，旨在从监管-学术-生产等多个角度对LC-MS技术在临床利用中的现状、可能碰到的问题和如何对其进行监管等进行了深入讨论。下文将对此会议内容进行简述，为国内相干研究机构、生产企业和政府监管机构提供新进展。

快盈llI下载app 即便在美国，LC-MS在临床检测中的利用也仅处于起始阶段。根据华盛顿大学教授Andy Hoofnagle提供的数据，在全美7700家取得CAP认证的实验室中，采取LC-MS技术的实验室大约只有不超过200家，比例不超过总实验室数量的2.6。具体展开项目可参见下表1。

快盈llI下载app 表1 采取LC-MS技术进行检测的CAP实验室数量1览表

快盈llI下载app 随着技术的不断进步，目前美国能够采取LC-MS进行检测的蛋白/多肽临床项目有14项，以下表2所示。

表2 美国采取LC-MS技术进行检测的蛋白/多肽项目1览表

LC-MS技术是不是能够与其他技术1样，在临床利用中得到认可，我们可以从某1项具体的检测项目中稍作了解。以25-羟基维生素D为例，可进行此项检测的方法和仪器都有很多种，所以可以从CAP的能力验证测试结果对LC-MS的检测能力进行了解，以下表3所示。

表3 25-羟基维生素D检测能力验证结果

从以上结果可以看出，LC-MS技术可以满足能力验证的要求，是可以利用于临床检验领域的。

作为先进的药物监管单位，FDA在此次会谈中也派出了多名官员，从产品分类、注册流程、技术参数等方面对LC-MS的临床注册工作进行了详细的介绍。

快盈llI下载app 在美国，早在1976年的医疗器械修正案就要求所有医疗器械必须合法进入市场，因此1976年以后的所有医疗器械必须全部经过FDA审批，才能进入市场。

至于大家耳熟能详的体外诊断试剂相干产品，根据美国联邦法规21 CFR 809.3条款，可理解为是医疗器械的1个亚类，其是旨在用于诊断疾病或其他不适的试剂，仪器和系统，包括对健康状态的判读，从而用来治愈、减缓、医治或预防疾病或其后遗症。FDA根据风险，将医疗器械分为3类，类为低风险，1般性控制就能够;第2类为中度风险，1般性控制通常还不足够，常常需要进行特殊控制;第3类为高风险，可对患者或使用者造成过度的伤害或疾病风险，和对生命保持系统和人类健康造成重大损伤。目前要通过FDA批准才能进入市场主要有3种方式，种是上市前通告，也就是常说的510，另外一种是重新审批De novo，还有1种是上市前申请PMA。

快盈llI下载app 510包括部份I类产品和大部份的II类产品，FDA根据其是不是与之前的上市产品具有实质性同等来进行许可，目前，进行此类申请需要先找到1个与申请标的类似的产品并有类似的预期使用范围。FDA需要90天来给出答复。终的决定书概要会公布在上。

De novo种别是针对目前市场上还没有前置产品的低风险到中等风险装备。根据具体情况进行I类或II类的划分，需要120天给出答复，De novo产品会成为以后具有相同预期用处产品类型的前置产品。

快盈llI下载app PMA种别是针对III类产品的，其不需要前置产品，需要证明其安全性和有效性，可以要求在进行批准前征求顾问委员会的决定，其安全性和有效性数据会在上公然，需要180天给出答复。

从FDA的角度动身，其职能在于要确保医疗器械、包括IVD产品，能够公道地安全且有效地实现其预期使用目的。所以，对其进行分析性验证是实现注册审批的步。具体到LC-MS相干装备及IVD产品时，则主要包括以下关键内容：需要明确论述何种被检物是通过IVD进行度量或检测的，需要进行IVD检测的样品或样本类型，所申报IVD产品的底层技术，所实行检测的类型，适用于所申报测试的患者人群，检测结果的临床目的，包括所提供装备能够检测的疾病/不适的诊断)，所实行检测的参数设置，和有可能取得检测结果的参数设置。

分管医疗器械审批的具体部门CDRH，及其下属分支中重要的两个办公室ODE和OIR在本次会谈中特别指出，建议各申报单位在进行触及基于蛋白和多肽的LC-MS相干产品申报之前，好先提交1份预申报申请，从而能够与FDA进行关于充分交换，以避免在开始审批程序以后再对相干申报方案进行修改。这些建议的具体内容，包括，但不限于：

1.准确度和重复性

快盈llI下载app 就LC-MS相干产品而言，由于其触及的工作流程通常比较复杂，所以必须特别加以重视。需要斟酌到的步骤包括了从样品搜集直到终的数据输出和分析，和其中的某些特殊环节。

快盈llI下载app 斟酌到质谱技术可以1次对多种物资进行检测，因此，从1次质谱丈量得到的针对多个被检物的分析结果，可以被用作多重分析或可将其组合成为1个可接受的结果。但是，如果是多重分析，则要求所有被检物都需要在1个测试中被全部检测出来，而且每种被检物都要被单独进行评价和报告。例如，来自于患者样本中的1种或多种蛋白，即若干的不同被检物，可作为单独因素合并于某1算法中，从而提供1个终的、可接受的结果，例如预测某种疾病风险的分数。而FDA通常会需要申请人提供证据，说明每种被检物对终分数的贡献，和每种组分在各种浓度组合中对终分数的贡献。

2.线形度和回收率

对丈量多种被检物LC-MS相干产品而言，不管是单独或组合进行丈量，申请人都需要对每种被检物进行线形度和回收率的评估。

3.样本的结转

快盈llI下载app 根据某项分析的工作流程不同，有可能存在前序样本中含有新的样本，而对申请人而言，则需要对所述工作流程中有可能产生结转的每步骤都进行鉴定和评价。在FDA之前的受理进程中，的国内外尝试利用于可生物降解材料方面研究的植物蛋白主要有大豆蛋白、玉米蛋白、小麦蛋白、葵瓜子蛋白等确接到过这样的结转研究，即在包括所述装备的1系列全部工作流程中，在阴性或弱阳性样本中出现了强阳性的情况。

4.检测限/分析灵敏度：空白限、检测限和定量限

快盈llI下载app LC-MS相干产品依赖于质谱仪对峰值的检测与定量，或液相色谱中随洗脱时间对离子流的丈量。这两种丈量都离不开对高于系统中化学与电子噪声的峰的检测。在实际情况中，由于缺少可靠的空白样本，和LC-MS技术的较低背景噪声，要想肯定空白限常常是很难实现的;但是，如果某些临床检4、实验步骤：测的判定点接近于1起的灵敏度极限时，LoB就显得相当重要了。LC-MS产品的检测限是采取信噪比的低值计算出来的。在不同的装备中，信噪比常常是不1样的。

5.分析特异性与干扰

对LC-MS产品而言，主要有两类干扰物会影响对被检物的丈量与定量。1类是存在于样本中的同重离子或近同重离子，此类离子能够在质谱仪中被同时检测到，从

而对正确离子的检测和定量造成干扰。因此有必要对这些干扰物的存在与否进行评估，从而阐明是不是这些干扰物的存在会影响到所述装备的安全性和有效性，还需要斟酌到在标准操作条件下质谱仪的份子量分辨率。

6.样品制备

对LC-MS相干装备而言，其样品制备、特别是触及到蛋白和多肽的样品制备是非常复杂的，也是在相干分析检测中产生不和不可重复性的主要缘由。因此，对操作人员、仪器、地点等各种变量进行控制的能力，都会对LC-MS产品的安全性和有效性提出挑战。

7.内标

对那些需要进行大量样品制备的LC-MS相干产品而言，内标的加入可以在全部工作流程中对不同步骤进行监控，从而了解被检物的鉴定和定量信息。1般而言，内标的加入时间在全部分析流程中越早越好。内标的加入还可以实现在不一样本、校准品和对比品中对被检物值进行规范化。

8.校准品和对比品

快盈llI下载app 校准品是用来将装备的原始输出值转化成被检物浓度的参考，这样的浓度可用于构成具有临床判断价值的数据。除已知浓度的被检物以外，对比品通常需要含有固定数量的内标，从而能够在校准品和患者样本之间提供相对定量。在本文中，对比品是指对全部体系表现进行验证的材料，即阳性对比和阴性对比。这样的对比品并不是是用于LC-MS相干产品流程控制中的标准品或内标。

9.对照方法

快盈llI下载app 通常，FDA都会以WHO和/或NIBSC的方法作为某1具体被检物的金标准。标准参考方法也通常是指为了获知目标条件有没有2采取的易取得的方法。很多时候，在针对同1种被检物的时候，可以有很多种不同的检测方法，当某1方法具有与提交申请具有相同的预期使用目的时，通常被称为前置方法。斟酌到LC-MS装备的输出结果与大多数仪器，例如免疫分析的输出结果不同，因此要想直接对两种仪器进行比较是很困难的。要解决这1困难，且目前还没有金标准或参考方法的情况下，FDA也能够斟酌接受经过与临床真实的仪器性能进行过对照和证实的申请。

10.蛋白/多肽的选择

快盈llI下载app 除少数不需要经过蛋白裂解就可以够被轻易检测到的小份子生物活性多肽以外，绝大多数的多肽都是作为完全蛋白的代表。申请人可自行选择合适于其申报检测项目的多肽，固然这些多肽的生物物理性质会影响其检测项目的表现，包括体内或在工作流程中对翻译后修饰的敏感性，胰酶水解的速率和效力，多肽在样本和工作流程中的稳定性等等。

11.峰选择

峰的选择与评价对LC-MS产品的表现而言相当重要。影响液相色谱洗脱峰分辨率和重复性的因素包括色谱柱的选择，缓冲液，流速和温度等等。FDA之前就曾要求过申请人提交相干数据，证明在临床实验室可能碰到的各种操作条件下，色谱峰的分辨率和重复性可以满足审批要求。即便目前缺少某些内标，FDA也可要求申请人提供数据，确保正确的峰和离子可以被检测和定量。

对挑选色谱峰的软件进行选择和评价也10分关键，特别是在那些被检物接近于低定量限的样本中，申请人需要对选峰软件的准确性和重复性进行评估，并理解其重要性。

快盈llI下载app 12.核心IVD组件

对LC-MS相干的产品而言，有很多耗材和组件都是必须的，例如色谱柱，胰酶的来源和类型，免疫亲和抗体，免疫耗竭柱等。根据FDA之前的经验，对核心组件中的任意1种进行更换，都会致使分析进程中某种成份的改变，乃至需要对全部分析进程进行重新验证。

申报文件需要参考的相干标准文件以下表4所示。

表4 FDA申报进程中的CLIA和CLSI指点性文件1览表

快盈llI下载app 来自美国国家标准与技术研究院的Mark Lowerthal也就在临床质谱实验室中实行标准化等内容进行了讨论。主要触及3个核心问题，是需要建立1个参考检测体系，第2是需要使用科学的标准体系，第3是需要建立可追溯的数据链，以下图1所示。

图1. 从标准物资到临床实验室检测的可追溯数据链

快盈llI下载app Mark博士也就蛋白/多肽标准品的制备与分析提供了很多有价值的参考数据，比如合适于作为氨基酸分析标准品的氨基酸可选自，但不限于，丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和缬氨酸等，和如何采取LC-UV，即NMR方法进行纯度分析。

利用LC-MS技术对蛋白/多肽进行检测，大的困难是来自于对样本的预处理，即对蛋白/多肽进行消化、分离和提取的步骤。来自美国实验室团体的Christopher Shuford博士通过计算机分析与计算，提出了根据对蛋白序列进行N-连接糖基化、O-连接糖基化、碘化、甲硫氨酸、半胱氨酸位点分析还没有验收通过等方法，进而能够在胰酶水解之前对目的蛋白进行更加详细的分析，从而有针对性地进行目的蛋白的富集，进而提高后的质谱检测灵敏度与特异性。

不管是在LC层析的进程，还是MS检测进程中，每个峰的产生都是根据检测器对光电信号的响应而得到的，而当样本中的物资较多时，相邻的峰常常会出现叠加或干扰的情况，这1直都是仪器分析中的困难。来自Indigo BioAutomation的科学家特别就这1问题提供了新的专业建议。该公司在过去几年中，已处理了超过10亿张色谱图，针对LC-MS在临床中的利用，该公司建议首先要避免对原始数据进行修饰，从而能够下降验证的风险，即提供稳定的基线和收集完全的峰;其次要避免对数据进行调剂，从而能进行校订，即能够对某个模型进行验证，并可在有效线性范围以外进行稀释;第3对校订进程进行设计，从而取得好的统计学效果，即如果所得曲线是线性的，则可采取随机的、可重复的水平来丈量变异，并据此来表征仪器的状态，或使用间隔的区间来丈量非线性的情况。

快盈llI下载app 质谱技术是目前比较先进的丈量技术，能够提供相干仪器的厂家主要有赛默飞世尔、安捷伦、沃特世、布鲁克、爱博才思和岛津公司。但每家制造商对其装备都有不同的设计，这样就致使在信号收集，数据格式、结果评估等各个环节都不尽相同，很难将其进行比较，更不用说能够进行标准化操作。为了解决这1困难，华盛顿大学的Jarrett Egertson教授带领其团队与上述6家公司进行了长时间的沟通、谈判，终与所有公司都达成了共鸣，并在NIH的资助下，经过8年时间，开发出了世界上1款能够将各种不同质谱数据进行比对的软件-skyline，使得不同类型质谱之间的数据可以相互比对和验证，大大方便了LC-MS的使用者。该软件现在已包括了400,000开起源代码的峰，还有60,000峰在检测进程中，已有超过7000个注册用户。

快盈llI下载app 固然，我们也知道在LC-MS的临床利用进程中，也存在许多亟待解决的问题，比如，样本中的内源和外源干扰物。除诸如血红蛋白的内源干扰物，来自于患者服用的药物，采血管内的化学成份，和从干血片上洗脱下来的物资等外源干扰物也都5月6日能产生峰，从而在分析和解读进程中对目标被检物峰造成干扰。另外，还有1些其他的干扰因素，比如自然界中的同位素，C⑴3，Cl⑶7，在实际工作中是不容易区分开的;有些同重份子，C19H28O2和C18H24O3，大多数4级杆质谱仪也不能对他们进行辨别;还有1些多电荷的状态，如CHARGESTATE 3和PEPTIDC 2等，也很难通过常规的LC-MS方法得以有效辨别。

而且，相对现在自动化程度较高的生化、免疫和化学发光等方法，LC-MS技术在很大程度上对操作人员能力的要求也比较高，因此在我国的展开还需要按部就班。

快盈llI下载app 但从技术的进步来看，质谱技术的优势就在于能够准确的对蛋白/多肽进行检测和定量，而蛋白/多肽相干生物标志物势必成为未来的临床检测新增长点，所以LC-MS技术将会很快得到长足的发展，我们也将对这1领域进行延续关注。

编辑点评

最近几年来，随着质谱技术的发展及普及，其在临床诊断中的利用也愈来愈多。但同国外相比，中国在此方面发展较晚。国家食品药品监督管理总局早批准质谱技术利用于临床是在2008年。截至目前，CFDA批准的可利用于临床的质谱技术和方法共17个，其中进口厂商申报的9个，国产厂商申报的8个。以下为17个取得CFDA批准利用于临床的质谱技术和方法详细情况。